免疫荧光染色

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项目介绍

免疫荧光染色是一种生物医学技术,用于检测和可视化组织或细胞中的特定蛋白质、抗原或分子。它使用荧光标记的抗体来结合并识别目标分子,从而使这些分子在显微镜下呈现出荧光信号。这项技术广泛用于细胞生物学、免疫学、分子生物学和临床病理学研究中,以研究蛋白质的定位、表达水平和相互作用。

以下是免疫荧光染色的主要步骤:

  1. 样品制备:样品可以是组织切片、细胞培养物或其他生物样本。它们需要在载玻片或培养皿上进行适当的固定、清洗和固定处理,以保持其形态结构和抗原的完整性。
  2. 抗原检出和修复:组织样本中的抗原通常需要被修复以揭示其结构,类似于免疫组化。这可以通过加热或酶处理来实现。
  3. 抗体标记:选择合适的一抗(主抗体),这是检测感兴趣蛋白质或抗原的关键。一抗通常需要标记荧光染料,如荧光素、菲蓝、罗丹明等,或使用荧光标记的二抗。
  4. 抗体结合:加入标记的抗体(一抗或二抗)到样品中,使其与目标抗原结合,形成抗原-抗体复合物。
  5. 洗涤:洗涤步骤用来去除未结合的抗体,减少非特异性结合。
  6. 细胞核染色(可选):如果需要染色细胞核以显示细胞核的位置,可以使用荧光染料,如DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)。
  7. 封片:样品通常会被封在载玻片上,以保护样品并准备观察。
  8. 显微镜观察:最后,使用荧光显微镜观察标记的抗体在样品中的分布和表达水平。不同的荧光染料会在不同波长下发出荧光信号,因此可以用多通道荧光显微镜同时观察多个标记。
取样要求
  1. 样品类型:样品可以是组织切片、细胞培养物、细胞悬液或其他生物样本。样品类型将决定取样和准备方法。
  2. 固定和保存:样品必须进行适当的固定以保持其形态结构和抗原的完整性。福尔马林(formalin)通常用于固定组织样本。已固定的样本应妥善保存以避免抗原降解。
  3. 抗原修复:抗原修复步骤是非常关键的,因为它有助于揭示隐藏的抗原结构。选择合适的修复方法和条件,如加热诱导抗原修复(HIER)或酶诱导抗原修复。
  4. 样本处理:样本需要进行适当的处理,包括切片制备(对于组织切片)或细胞固定和孵育(对于细胞)。
  5. 抗体选择:选择适当的一抗(主抗体),确保其特异性和亲和性与目标抗原匹配。
  6. 负对照:同时进行负对照实验,使用不含目标抗原的样品或使用已知不含该抗原的细胞/组织样本,以验证实验的特异性。
  7. 洗涤:使用适当的缓冲液进行洗涤步骤,以去除未结合的抗体和其他非特异性结合物。
  8. 封片:将样本封在载玻片上,以保护样品并准备观察。
  9. 显微镜观察:使用荧光显微镜观察样本,确保仔细检查标记的抗体在样本中的分布和表达水平。
  10. 存储条件:保存未使用的样本和抗体在适当的温度下,通常是在4°C或更低温度下。
常见问题
  1. 背景荧光:问题:背景中出现非特异性的荧光信号,使得难以识别目标信号。解决方法:使用适当的阻断剂,如非脂奶粉、BSA(牛血清白蛋白)或动物血清,以减少非特异性结合。此外,优化洗涤步骤也有助于减少背景荧光。
  2. 荧光信号弱:问题:荧光信号较弱,使得难以检测或观察。解决方法:检查抗体浓度是否合适,可能需要尝试不同浓度的一抗或二抗。确保样品的抗原修复和洗涤步骤充分。
  3. 核染色问题:问题:核染色荧光信号不明显或不均匀。解决方法:使用适当的核染色荧光染料,如DAPI,确保荧光染料的适当浓度和均匀分布。
  4. 荧光叠加:问题:不同波长的荧光信号叠加在一起,使得难以分辨不同标记的信号。解决方法:选择具有不同激发和发射波长的荧光染料,以减少叠加。使用适当的光学滤波器来隔离不同的荧光通道。
  5. 非特异性结合:问题:抗体可能与不相关的抗原结合,导致假阳性结果。解决方法:仔细选择和验证抗体,使用负对照实验,确保抗体的特异性。
  6. 光照问题:问题:光源或显微镜可能存在问题,如灯泡老化或光源不稳定。解决方法:确保光源的正常工作状态,定期检查和维护显微镜设备。
  7. 样本制备问题:问题:样本可能存在问题,如固定不充分、抗原修复不当或样品老化。解决方法:确保采用标准的样本制备和处理步骤,对于老化的样本,可能需要重新制备。
  8. 抗体质量问题:问题:使用的抗体可能质量不佳,如受污染或陈旧的抗体。解决方法:使用高质量、新鲜的抗体,确保抗体的存储和使用符合最佳实践。
  9. 数据分析问题:问题:数据分析时可能存在问题,如信号强度的误判或不适当的图像处理。解决方法:仔细进行数据分析,使用合适的分析工具和软件,确保准确的结果。
服务优势

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