蛋白表达系统

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项目介绍

蛋白表达系统是一种用于合成蛋白质的生物技术工具,通常用于在实验室中大规模生产特定蛋白质。这些系统通过使用生物学、生物化学和分子生物学技术,将外源基因(通常是编码特定蛋白质的基因)导入宿主细胞,使它们表达并生产所需的蛋白质。蛋白表达系统广泛用于科研、生物制药、工业生产和医疗诊断等领域。

以下是一些常见的蛋白表达系统:

  1. 大肠杆菌表达系统:大肠杆菌(Escherichia coli)是最常用的蛋白表达宿主之一。它具有快速生长和易于操作的优势,因此通常用于表达小型蛋白质。然而,对于复杂蛋白质或需要正确折叠的蛋白质,大肠杆菌可能不适用。
  2. 哺乳动物细胞表达系统:哺乳动物细胞,如CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞或HEK293细胞,通常用于表达复杂蛋白质,因为它们可以正确折叠和糖基化蛋白质。这些系统常用于生物制药领域。
  3. 酵母表达系统:酵母(Saccharomyces cerevisiae)是单细胞真核生物,被广泛用于表达重组蛋白质。酵母表达系统适用于一些蛋白质,但不适用于所有类型的蛋白质。
  4. 昆虫细胞表达系统:昆虫细胞,如昆虫卵巢细胞SF9或SF21,用于表达复杂蛋白质,特别是用于研究蛋白质糖基化和蛋白质复合物的形成。
  5. 植物细胞表达系统:植物细胞,如拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞或大豆细胞,用于生产药物、蛋白质和疫苗。植物细胞表达系统通常需要更多的时间和资源。
  6. 细胞-free系统:细胞-free系统,如细胞外蛋白质合成体系(cell-free protein synthesis systems),可以在不涉及细胞的情况下表达蛋白质。这对于高通量蛋白质表达和定制蛋白质合成非常有用。
  7. 合成生物学方法:合成生物学技术允许设计和构建合成生物学平台,用于合成复杂蛋白质和其他生物分子。这些系统的灵活性和可编程性使其在合成生物学研究中非常有前景。
取样要求
  1. 细胞培养取样:培养条件:确保细胞在适当的培养条件下,包括适当的培养基、温度、湿度和CO2浓度。培养时间点:在表达蛋白质的合适时间点进行取样,以获得最佳的表达。细胞数量:取样时需要确定细胞数量,以便计算蛋白质的表达量。
  2. 培养基和培养液取样:培养液清晰度:培养液应该清澈,没有可见的细胞或细胞碎片。取样体积:取足够的培养液样品进行后续的分析,如蛋白质浓度测定或纯化。
  3. 细胞破碎和细胞抽提:破碎条件:对于细胞破碎或细胞抽提,使用适当的条件和缓冲液来保持蛋白质的活性。离心:确保将破碎后的样品进行离心,以去除细胞碎片和细胞核。
  4. 纯化取样:洗涤条件:在蛋白质纯化过程中,取样前后要考虑洗涤条件的一致性。洗涤液样品:取一些洗涤液样品以确定蛋白质是否已被充分纯化。
  5. 荧光定量和分析:荧光标定曲线:如果进行荧光定量,建议使用标定曲线来定量蛋白质样品。
  6. 分子生物学分析:DNA或RNA样品:如果您需要进行分子生物学分析,确保取得足够的DNA或RNA样品来进行PCR、RT-qPCR、Western blot等分析。
  7. 质量控制:取样记录:记录每个取样的日期、时间、样品标识以及相关的培养条件和处理步骤。样品保存:根据实验需求,样品可能需要在 -80°C 或更低的温度下保存,确保样品不会降解。
  8. 无菌技巧:对于细胞培养或细胞抽提,遵循无菌技巧,以防止细菌或其他微生物污染。
常见问题
  1. 低表达水平:问题描述:蛋白质表达水平较低,难以检测或纯化。解决方法:尝试以下措施:优化表达宿主细胞的菌株和表达载体。调整诱导条件,例如改变诱导剂的浓度、温度和诱导时间。考虑使用更强大的表达载体或启动子。优化蛋白质的结构或稳定性。
  2. 毒性问题:问题描述:表达的蛋白质对宿主细胞具有毒性,导致细胞生长受到抑制。解决方法:尝试以下措施:降低诱导蛋白质表达的温度或浓度。使用诱导缓冲液或培养条件,以减轻蛋白质的毒性。考虑使用调控表达系统,如温度敏感的启动子。
  3. 蛋白质不稳定:问题描述:表达的蛋白质容易降解或失活。解决方法:尝试以下措施:添加蛋白质稳定性标签,如His标签、GST标签等。将表达温度降低到适宜蛋白质折叠的温度。使用蛋白质稳定性增强剂。
  4. 错误的表达载体或基因序列:问题描述:使用了错误的表达载体或基因序列,导致蛋白质表达不成功。解决方法:仔细核对使用的表达载体和基因序列,确保其正确性。
  5. 蛋白质包含结构域:问题描述:蛋白质表达中可能包含未期望的结构域或剪切变体。解决方法:使用质谱或Western blot等技术来鉴定蛋白质的结构和纯度。
  6. 蛋白质聚集:问题描述:蛋白质可能在表达或纯化过程中发生聚集,导致纯化困难。解决方法:尝试以下措施:优化蛋白质纯化过程,例如通过添加辅助剂来避免聚集。改变表达条件,以减少蛋白质聚集的可能性。
  7. 蛋白质可溶性:问题描述:蛋白质可能在表达后不溶解或形成包含体,使其难以纯化。解决方法:尝试以下措施:调整表达条件,以提高蛋白质的可溶性。使用亲水性柱进行纯化,以去除不溶解的蛋白质。
  8. 细胞培养问题:问题描述:细胞培养可能受到污染、感染或细胞质量差的问题。解决方法:保持无菌技巧,定期检查细胞培养的健康状态。
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